重组人胸腺素的研制
军事医学科学院生物工程研究所
一、目标产品
胸腺素（Thymosins）是由胸腺产生的一种淋巴生长因子，由Goldstein和White于1966年首次从胎牛胸腺蛋白提取液中发现，是一组小分子多肽，含有40多种组分。根据这些多肽在等电聚焦电泳分析图谱上的位置，可以划分为α、β、γ三个型：PI(α)＜5，5＜PI（β）＜7，PI（γ）＞7。胸腺素α1（Tα1）和胸腺素β4（Tβ4）是其中的主要成分。
Tα1是从TF5中分离得到的第一个胸腺肽，由28个氨基酸组成，具有N末端乙酰化修饰，其一级结构为：Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN，平均分子量3108kD，等电点为4.2。Tα1能够促进Ｔ淋巴细胞分化、增殖、提高细胞免疫功能的作用，是治疗慢性乙肝、丙肝、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤和神经胶质瘤的重要药物之一。
Tβ4是一个N末端具有乙酰化修饰的43肽（Ac-SDKPDMAEIEKFDKSKLKK TETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES），平均分子量为4964Da，等电点为5.1。Tβ4是具有抗炎、促进创伤愈合的多肽，应用于皮肤创伤愈合、眼角膜损伤修复、干眼症治疗、心肌损伤修复、神经损伤修复以及化妆品领域（使皮肤年轻化、恢复皮肤的弹性，消除老年斑等）。
二、技术特点及优势
Tα1和Tβ4是从TF5中分离得到的多肽，分别由28个和43个氨基酸组成，均具有N-末端乙酰化修饰。由于基因工程技术难以解决小分子多肽的表达以及N-末端乙酰化修饰难题，目前在临床研究中应用的为化学合成产品。
多肽的化学合成，原料价格高，工艺复杂、收率低，而且合成过程中用到许多有毒物质，对环境污染较大。利用基因工程技术规模化制备胸腺素可以降低成本，减少污染。
本项目解决了生物合成胸腺素的两大难题。
2.1 利用优化Intein融合表达技术高效合成小分子多肽
我们应用一种特殊Intein（蛋白质内含肽）介导的切割技术，建立了小分子多肽的融合表达及切割技术平台。借助该平台，成功地实现了胸腺素的高效生物合成。其技术如右图所示。
图1 利用Intein介导切割技术制备多肽
2.2 与N-末端乙酰转移酶共表达实现体内胸腺素的乙酰化修饰
多肽的N-末端乙酰化修饰是由N-末端乙酰转移酶（NAT）将乙酰辅酶A的乙酰基团（CH3CO-，分子量43.018 Da）转移到蛋白质氨基末端的α-氨基上。
图2 多肽N-末端乙酰化修饰的机制
细胞内多肽要获得乙酰化修饰至少需要两种条件，一是适当的N-末端序列，二是要有合适的NAT活性存在，因为每一种NAT都有特定的底物群体。
为了实现胸腺素的N-末端乙酰化修饰，我们利用基因敲除筛选技术及基因补救方法，找到了可以修饰Tα1和Tβ4的NAT。将NAT与胸腺素融合蛋白共表达可以使胸腺素得到充分乙酰化修饰。
2.3 技术集成
图3 高效生物合成胸腺素
如上图所示，本项目应用Red重组技术将特异的NAT整合到大肠杆菌染色体上，获得稳定表达NAT的宿主，然后将构建的高表达Intein融合蛋白质粒转入其中，得到高表达工程菌。应用高密度培养技术，经过纯化、切割、精细纯化，每升培养液可以获得纯度>98%的重组N-末端乙酰化胸腺素200mg，达到国际领先水平。已申请中国发明专利1项（申请号：200910077750.8；公开号 CN101497863A），另1项发明专利正在申请中。
2.4 与化学合成方法比较
2.4.1降低成本50%
本课题采用合成生物学技术，改造大肠杆菌使其能够充分对Tα1进行乙酰化修饰，从而直接表达获得完全乙酰化修饰的Tα1。该技术已申请中国专利（申请号：200910077750.8；公开号 CN101497863A）。应用我们的生产工艺，从每升发酵液中可以提取200mg纯品（纯度大于98%），其结构与化学合成的Tα1完全一致，成本不到2元/mg，而化学合成的成本在3元/mg以上，直接降低生产成本50%。因此，本课题所实施的技术具有低成本优势。
2.4.2减少环境污染
本技术还具有环保优势。采用生物合成方法可以避免化学合成中需要使用的大量有毒化学试剂，特别是体外乙酰化修饰需要应用管控化学品乙酸酐。
2.4.3生产规模更容易放大
生物合成方法采用微生物培养技术，很容易放大。超大规模（几百吨）微生物培养技术在国际、国内都非常成熟，并在抗生素、氨基酸、有机酸等生产领域广泛应用。而多肽的化学合成规模放大有一定的限制。
三、市场分析
3.1 Tα1的市场应用潜力巨大
我国是一个肝炎大国，有近亿肝炎患者。每年用于肝炎治疗的费用高达几百亿元。相关药物市场潜力巨大。我国的丙肝发病率及死亡率急速上升，危害性日趋严重。2009年报告的发病人数是2003年的6倍多，死亡率窜升到传染性疾病第五位。
恶性黑色素瘤是所有恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤，年增长率约3-5%。据报道美国每年新发病例约6万人，死亡约8千人。中国和日本等亚洲国家发病率低，但是增长迅猛。北京市八城区统计资料显示2000年恶性黑色素瘤发病率为0.2/10万，2004年其发病例率已达1/10万。平均发病年龄为45岁，50岁以后随年龄增长而增高。北京肿瘤医院资料显示（2003年-2006年的110例MM患者）中位发病年龄51岁，其中60岁以上的老年患者占33%。
肺癌是临床的常见肿瘤之一,其中非小细胞肺癌占80%左右。据世界卫生组织统计，全球每年肺癌和支气管癌的新发病例超过120万，每年因此而死亡的人高达约110万，已经成为全球男性和女性的第一癌症杀手。其中非小细胞肺癌发病率较高，仅2002年全球新增非小细胞肺癌患者的数量达到100万多例。
在神经上皮组织肿瘤中,神经胶质瘤(简称胶质瘤)的发病率约占50%。
Tα1是一种生物反应调节因子，具有重要的免疫调节活性，在感染性疾病和癌症治疗方面具有潜力。在实验动物模型中能够治疗肝炎、流感、肿瘤等。其优点是无任何副作用。Tα1在临床上的应用主要有三方面：
(1) 病毒性传染病的治疗，对乙型肝炎、丙型肝炎的疗效尤为突出；
(2) 神经胶质瘤、非小细胞肺癌及黑色素瘤等一些恶性肿瘤的治疗；
(3) 提高机体免疫机能，增强对流感的抵抗力。
Tα1属于免疫制剂中高端产品，具有使Ｔ淋巴细胞分化、增殖、提高细胞免疫功能的作用，能破坏其感染的靶细胞，还可激活ＮＫ细胞活性，促进与免疫相关的细胞因子的产生，是治疗慢性乙肝、丙肝、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤和神经胶质瘤的重要药物之一。未来市场应在几十亿元以上。
3.2 Tβ4的应用前景诱人
由于机算机、空调的普及，人们视频工作时间过长，环境污染,配带角膜接触镜，角膜屈光手术及内眼手术的发展，干眼症的发病率逐年增高,并有年轻化的趋势。据调查，干眼症的发病率为28.7%，其中女性发病率33%，男性发病率22%，严重干眼症16%，角膜接触镜配戴者的发病率(50.1%)明显高于非角膜接触镜配戴者(21.7%)。
干眼症,又称角结膜干燥症，是指各种原因引起的泪液质和量或动力学的异常,常导致泪膜不稳定和眼表面组织病变，并伴有眼部不适症状为特征的一类疾病的总称。现有的治疗干眼症的方法主要是人工泪液替代疗法，但是多数人工泪液均含有防腐剂，而防腐剂又是诱发干眼症的原因之一。此外，人工泪液与眼泪毕竟还是存在区别，很难避免不会对眼睛造成刺激。干眼症治疗药物已成为药物研究热点之一，市场潜力有几百亿元。
Tβ4具有能促进眼睛退化的逆转或抑制眼睛退化，例如干眼综合症所导致的眼睛退化。可能的临床应用可包括由于发炎病症而引起的疾病，如干眼、葡萄膜炎、虹膜炎、白内障手术后发炎、激光原位角膜磨镶术（LASIK）或激光屈光性角膜切削术（PRK）。因此，Tβ4的未来市场应用前景诱人。
四、竞争分析
胸腺素类产品属于免疫调节剂类高端产品，目前市面上主要为化学合成产品，生产成本高，价格高，不能被广泛应用。
本项目采用拥有自主知识产权的、国际先进的生物合成技术，降低了生产成本，且更容易放大生产规模，处于国际领先水平。已申请发明专利。未来将具有很强的竞争力。
五、研发计划（全程进度计划）
5.1 研究内容及安排计划
rhTα1的开发研究：黑色素瘤、神经胶质瘤和非小细胞肺癌的辅助治疗。
rhTβ4的开发研究：干眼症及角膜手术后恢复治疗、皮肤创伤愈合、急性心肌梗塞等。
5.2 课题年度任务和考核指标
| 年度 | 年度任务 | 年度考核指标 | 重要任务的时间节点 |
| 第一年 | 完成实验室研究 | 获得结构确证报告、专利申请和维护、初步药理毒理报告 | 已完成 |
| 中试工艺初步研究 | 中试工艺标准建立、中试质量标准建立与验证 | 正在进行之中 | |
| 药理毒理初步研究 | 完成急性毒性、药效学研究并形成报告，进行阶段性初步药代试验 | | |
| 第二年 | 完成中试工艺研究 | 完成三批报批样品生产与检验，完成加速稳定性6个月研究及长期稳定性12个月的研究 | |
| 完成药理毒理研究 | 完成药代试验，长毒、毒代试验并形成药理毒理研究总结报告 | ||
| IND资料递交SFDA | 完成申报临床的全部文件并能向国家食品药品监督管理局 | ||
| 第三年 | 样品申报资料的跟踪及补充资料的准备（若需要） | 完成现场考核和抽样、送样检测，通过评审会，完成补充资料的递交 | |
| 长期稳定性研究试验 | 完成二到三批稳定性样品的研制和长期稳定性24个月研究 |
六、研究团队
该项技术由军事医学科学院生物工程研究所完成，该所长期从事生物技术药物开发研究，先后完成了霍乱毒素B亚单位工程菌复合苗、rhIL-2、rhEPO、rhpro-UK等新药，并成功转让企业。项目负责人长期从事重组蛋白药物及合成生物学研究，曾获得国家科技进步二等奖1项，国家新药证书1项，所研究项目成功转让企业。
本项目负责人：方宏清，博士，军事医学科学院生物工程研究所合成生物学研究室副主任，课题组长。主要从事基因工程、代谢工程及合成生物学研究。曾获：军队科技进步二等奖1项，国家科技进步二等奖1项，国家新药证书1项。主要人员参加的新药“基因工程rBS-WC霍乱疫苗”已在上海联合赛尔公司成功生产销售。在本课题研究中已成功构建表达人胸腺素α1和胸腺素β4的基因工程菌，并成功实现了乙酰化修饰（目前尚未见文献报道）。目前开展的项目有小分子多肽的生物合成，传染病及肿瘤疫苗，类异戊二烯类化合物代谢途径改造及优化，芳香族氨基酸的生物合成等。
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